Practica.- Introduccion a Tecnicas

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PRÁCTICA 1.- TÉCNICAS HISTOLÓGICAS USADAS MÁS FRECUENTEMENTE EN ANATOMÍA PATOLÓGICA

Procedimiento básico de procesado de los tejidos

  1. Fijación: aldehídos (Formaldehído), agentes oxidantes, sales mercuriales, alcohol ...
  2. Procesamiento, embebido en parafina.
  3. Corte en microtomo.
  4. Tinción.

TINCIÓN BICROMA ESTÁNDAR

English: Photomicrograph of hematoxylin stained section of normal ependymal cells at 400x magnification.
Corte longitudinal de fibras musculares esqueléticas teñido con Eosina.
English: Intermediate magnification micrograph of an angiokeratoma. H&E stain.
 * Hematoxilinas: de Harris ...
 * Eosina
 
  Resultados: El núcleo se tiñe de azul oscuro, el citoplasma de varios tonos de rosa, las fibras musculares de rojo rosado fuerte, los glóbulos rojos de naranja/rojo y la fibrina de rosa fuerte.

TÉCNICAS PARA EL TEJIDO CONJUNTIVO

 Soluciones empleadas: Ac. Pícrico (amarillo) y Fucsina (rojo). Contrastado con H férrica.
 Resultados: Los núcleos se tiñen de azul/negro, el colágeno de rojo y otros tejidos de amarillo. Tiñe el citoplasma (amarillo), la musculatura (amarillo), el amiloide (negro), la fibrina y el fibrinoide (rojo).
English: Masson's Trichrome stain of a paraffin embedded rat airway section. Nuclei are stained dark red/purple, cytoplasm is stained red/pink, and connective tissue is stained blue.
  • Colágeno.-
 * Tricrómico de Masson: Fuchina ácida, azul de metileno, ácido fosfotúngtico o solución de ácido fosfomolíbdico.
 
 Resultados: los núcleos se tiñen de azul-negro; el citoplasma, músculo y glóbulos rojos de rojo y el colágeno de azul
  • Fibrina.-
 * MSB (Martins, Scarlet, Blue): amarillo Martins, escarlata cristal brillante, ácido fosfotúngtico, azul de metileno, ácido acético glacial. 
 
 Resultados: Los núcleos se tiñen de azul, los glóbulos rojos de amarillo, el músculo de rojo, el colágeno de AZUL y la fibrina de ROJO.
  • Elásticas.-
 * Verhoeff: hematoxilina, cloruro férrico y solución iodada de Lugol. 
 
 Resultados: Las fibras elásticas se tiñen de NEGRO.
  • Reticulinas.-
 * Gordon y Sweets: solución 10% de nitrato de plata amoniacal.
 
 Resultados: Las fibras de reticulina se tiñen de NEGRO, los núcleos o se tiñen de negro o no se tiñen.
 
  * Gomori: 10% de Hidróxilo potásico y solución de nitrato de plata.

TÉCNICAS PARA PROTEÍNAS

  • Métodos histofísicos.
 Las proteínas fibrosas más frecuentes se pueden demostrar mediante métodos simples basados en la configuración física de sus moléculas en lugar de en su composición química. Estos métodos incluyen maniobras tales como la tinción selectiva con colorantes de moléculas pequeñas o grandes (por ejemplo, métodos de tricrómicos), precipitación de plata (métodos de reticulina, etc.) y agregación de colorante-proteína específicas (por ejemplo, la congofilia del amiloide). Usando estas técnicas, se pueden demostrar proteínas como el colágeno, fibrina, elastina, reticulina y amiloide.
  • Métodos histoquímicos para aminoácidos:
 Estos métodos demuestran la presencia de algunos de los aminoácidos constituyentes en lugar de moléculas de proteínas enteras. Se basan en la identificación de agrupaciones expuestas y enlaces dentro de las moléculas de aminoácidos.

 Grupos amino enlazados a proteínas:
 * Método Ninhydin-Schiff para grupos amino

 Grupos fenilo
 * Millon reacción para tirosina

 Enlaces disulfuro y sulfhidrilo
 * Método de ácido perclórico-Alciano (Adams y Sloper)

 Grupos indol
 * Método DMAB-nitrito para triptófano
 * La reacción modificada de Sakaguchi para arginina
  • Métodos histoquímicos enzimáticos.
 Las proteínas que tienen actividad enzimática se pueden demostrar en virtud de su efecto sobre su substrato específico, usando los principios de la histoquímica de la enzima.
  • Métodos de inmunofluorescencia.
 Los métodos de inmunofluorescencia permiten la identificación y localización precisa de ciertas proteínas en los tejidos. Las proteínas que se pueden identificar de esta manera incluyen las inmunoglobulinas IgG, IgM, IgA, etc., algunos componentes del sistema del complemento y diversas hormonas.
  • Métodos de inmunohistoquímica.
 Estos métodos tienen mucho éxito en la identificación y localización de proteínas de diversos tipos. En muchos aspectos, estas técnicas son incluso más adecuadas que los métodos de inmunofluorescencia ya que pueden aplicarse a secciones de parafina y resinas, permitiendo una localización mucho más precisa, incluso a nivel ultraestructural.

TÉCNICAS PARA ÁCIDOS NUCLEICOS

 * Reacción de Feulgen
   Resultados: El ADN se tiñe de rojo-púrpura y el citoplasma de verde.
 
 * Método de metiol verde-pironina 
   Resultados: el ADN se tiñe de verde-azul y el ARN de rojo.

TÉCNICAS PARA AMILOIDE

English: Very high magnification micrograph of cerebral amyloid angiopathy, commonly abbreviated CAA. Congo red stain.
 * Tinción con Lugol para piezas de tejido macroscópicas.
 * Rojo Congo de Highman . 
   Resultados: El amiloide, las fibras elásticas y los gránulos de los eosinófilos se tiñen de rojo y tiene birrefrigerancia en color verde cuando se examinan bajo luz polarizada. Los núcleos se tiñen de azul. 
 * Azul de Toluidina Standard.
   Resultados: El amiloide y muchos otros componentes de diversos tejidos tiñen de color azul ortocromático, pero cuando se examinan bajo luz polarizada, el amiloide produce una birrefrigeración de color rojo oscuro.

TÉCNICAS PARA CARBOHIDRATOS

English: Very high magnification micrograph of membranous nephropathy, abbreviated MN. MN may also be referred to as membranous glomerulonephritis, abbreviated MGN. Kidney biopsy. PAS stain.
 * Ácido periódico de Schiff (PAS)
 Resultados: El glucógeno y otros hidratos de carbono reactivos al peryodato se tiñe de magenta (en las secciones tratadas con diastasa, el glucógeno no se tiñe). El núcleo se tiñe de azul.
 
 * Carmín de Best
 Resultados: El glucógeno se tiñe de rojo oscuro; algunas mucinas y la fibrina de rojo débil; los núcleos de azul.

 * Azul alcian
 Resultados: Las mucinas ácidas se tiñen de azúl y los núcleos de rojo.
 
 * Diamina hierro pesado
  Resultados: Las mucinas sulfatadas se tiñen de negro-marrón, las mucinas carboxiladas de azul y los núcleos de rojo
 
 * Lectinas
 Estas son aglutininas de proteínas de origen no inmune que tienen la capacidad de combinarse con azúcares específicos o sus formas nitrogenadas. Si se combinan con un marcador como FITC o peroxidasa, las lectinas se pueden usar para demostrar restos de azúcares específicos en los tejidos. La mayoría de las lectinas son de origen vegetal, pero pocas se derivan de tejidos animales como los caracoles y las anguilas. Originalmente, a principios de la década de 1950, fueron estudiadas como agentes de aglutinación para glóbulos rojos y gradualmente han encontrado su camino en el repertorio histoquímico. Algunas semillas de planta con varios azúcares, p.e. el Ulex Europaeus contiene Ulex 1 específico para L-Fucosa y Ulex II específico para N-Acetil-D-glucosamina. Ejemplos de lectinas y sus afinidades de azúcar son:
 - Concanavalina (Jack Bean): manosa, glucosa
 - Pokeweed: N-acetil glucosamina
 - Wheatgerm: ácido siálico, N-acetil glucosamina
 - Ricino: galactosa

TÉCNICAS PARA LÍPIDOS

English: Highlight lipids (histology staining). Oil Red O method for lipids.
 * Sudan Negro.
 Resultados: El procedimiento estándar de la técnica de Sudan Negro tiñe los ésteres de colesterol insaturados y los triglicéridos de color azul-negro; algunos fosfolípidos aparecen grises y lípìdos en la mielina exhiben un dicroísmo bronce en luz polarizada.

 * Oil Red O (métodos para lípidos Rojo Oleoso O).
 Resultados: Los lípidos hidrófobos insaturados que son insolubles en el baño de colorante y los aceites minerales se tiñen de rojo. Algunos fosfolípidos se muestran de color rosa.

TÉCNICAS PARA PIGMENTOS Y MINERALES

Parénquima hepático donde encontramos una vena centrolobulillar (izquierda) y un espacio porta. Método de Van Gieson. Colágeno de rojo en el espacio porta.
Células argentafines. En el epitelio que reviste el tubo digestivo en general y particularmente en el intestino delgado existen unas células, poco numerosas, que son positivas a la reacción argentafín y que pertenecen al sistema APUD (sistema endocrino difuso). En esta imagen se observan estas células (flechas) dispuestas en el fondo del epitelio de una vellosidad intestinal. Duodeno humano. Tinción: Masson-Fontana. Aumento: x 1000.
 * Método de Fouchet-Van Gieson
 Resultados: Tiñe las sales biliares de azul-verdoso, el músculo de amarillo y el colágeno de rojo.
 
 * Sudán negro B
 Resultados: tiñe las lipofucsina y los eritrocitos de negro, el tejido de fondo se tiñe de gris pálido.
 
 * Masson Fontana 
 Resultados: tiñe la melanina, las células argentafines y cromoafines, algunas lipofuchinas y los núcleis de negro. 
 
 * Azul Prusia de Perls
 Resultados: tiñe el ión férrico de azul y los núcleos de rojo.

 * Método Alizarin Red S para el calcio
 Resultados: los depósitos de calcio se tiñen de rojo-anaranjado.

 * Técnica de ácido rubeánico para cobre.
 Resultados: el cobre se tiñe como gránulos verdosos-negros.

TÉCNICAS PARA MICROORGANISMOS

 * Método de Gram.
 * Ziehl-Neelsen para los bacilos de la tuberculosis.
 * Wade-Fite para las Mycobacterias de la lepra.
 * Warthin-Starry para las espiroquetas.
 * Grocott-Gomori, plata metenamina para hongos.

TÉCNICAS DE INMUNOHISTOQUÍMICA

English: The direct method of immunohistochemical staining uses one labelled antibody, which binds directly to the antigen being stained for. Fuente: Wikipedia.org
English: The indirect method of immunohistochemical staining uses one antibody against the antigen being probed for, and a second, labelled, antibody against the first.
English: HER-2 status characterization of xenografts by immunohistochemistry of HER-2.
English: Immunohistochemical staining of a non-neoplastic kidney with CD10 (Nephrilysin). CD10 stains both the glomeruli and proximal convoluted tubule. CD10 is often used in a panel of immunohistochemical stains, when there is suspicion of renal cell carcinoma (which is thought to arise from the proximal convoluted tubule).

Albert Coons conceptualizó e implementó por primera vez el procedimiento en 1941. La inmunohistoquímica es un procedimiento histopatológico que se basa en la utilización de anticuerpos que se unen específicamente a una sustancia que se quiere identificar (antígeno primario). Estos anticuerpos pueden tener unida una enzima o esta puede encontrarse unida a un anticuerpo secundario que reconoce y se une al primario. Aplicado a un tejido orgánico, el anticuerpo primario se une específicamente al sustrato y se aprovecha la actividad enzimática para visualizar la unión. De esta manera se consigue un complejo sustrato-anticuerpos-enzima unido al lugar donde se encuentre el sustrato y mediante la activación de la enzima con la adición de su sustrato se genera un producto identificable donde se encuentre el complejo.

Esta técnica permite identificar la localización de una sustancia tisular o citológica, identificando los marcadores antigénicos característicos de una línea celular, células que secretan una proteína, receptores de membrana, gradientes de concentración tisulares o células que han respondido a una hormona (con anticuerpos específicos para las vías de señalización intracelular).

La tinción inmunohistoquímica se usa ampliamente en el diagnóstico de células anormales, como las que se encuentran en tumores cancerosos . Marcadores moleculares específicos son característicos de eventos celulares particulares tales como proliferación o muerte celular (apoptosis). La inmunohistoquímica también se usa ampliamente en la investigación básica para comprender la distribución y localización de biomarcadores y proteínas expresadas diferencialmente en diferentes partes de un tejido biológico.

La visualización de una interacción anticuerpo-antígeno se puede lograr de varias maneras. En el caso más común, un anticuerpo se conjuga con una enzima, como la peroxidasa , que puede catalizar una reacción productora de color (ver tinción con inmunoperoxidasa ). Alternativamente, el anticuerpo también puede marcarse con un fluoróforo , como fluoresceína o rodamina (inmunofluorescencia).

Un laboratorio estándar de patología quirúrgica estará bien atendido adquiriendo la siguiente selección de anticuerpos:

La mejor opción:

  • Actina
  • Calcitonina
  • Calretinina
  • Cromogranina
  • CD31
  • CD34
  • Desmina
  • EMA
  • GFAP
  • hCG
  • HER2/neu
  • HMB-45
  • Receptores de hormonas (estrógenos, andrógenos)
  • Citoqueratinas (AE1/AE3, Cam 5.2)
  • MIB-1 (Ki67)
  • Miogenina
  • PSA
  • Proteína S-100
  • Tiroglobulina
  • TTF-1
  • Vimentina
  • WT-1

Deseables:

  • Alfa-fetoproteína
  • Alfa-lactoalbúmina
  • B72.3
  • CD10
  • CD117
  • CEA
  • Colágeno tipo IV
  • Antígeno Factor VIII-relacionado
  • Hep-Par-1
  • Inhibina
  • CK8, CK20, 34betaE12
  • Lisozima
  • Mart-1 (Melan-a)
  • Selección de microorganismos
  • Neurofilamentos
  • Fosfatasa ácida prostática
  • PLAP
  • Sinaptofisina
  • Lectina Ulex europeaus

PREPARACIONES QUE SE VERÁN EN ESTA PRÁCTICA

  • P01-01: 2 preparaciones de Bazo teñidas con Reticulina y tinción de Van Gieson para fibras elásticas.
  • P01-02: 3 preparaciones de Riñón teñidas con Van Gieson, PAS y Reticulina.
  • P01-03: 4 preparaciones de Hígado teñidas con H-E, PAS, Reticulina y Van Gieson.

Tiempo destinado para ver las preparaciones: 55 minutos. 

 Anexo 1.- Histología del Hígado.
 Anexo 2.- Histología GGLL.
 Anexo 3.- Histología del Timo.
 Anexo 4.- Histología del Bazo.


Galería de Imágenes de Prácticas: 

 Acceso a las Preparaciones Virtuales Introducción a las técnicas histológicas

Vídeos

  1. Microscopio Primo Star Zeiss
  2. Youtube: "Dra Lolita Álvarez" Técnicas histológicas. Universidad Autónoma de Guadalajara. México
  3. Youtube: "Dr. Ruiz" Tinción histológica
  4. Youtube: "Sanjay Mukhopadhyay" 7 must-know facts about napsin A

Referencias

  1. Wikipedia ES: Técnica histológica.
  2. Wikipedia ES: Tinción
  3. Wikiepdia EN: Histology
  4. Wikipedia EN: Common laboratory stains
  5. Wikipedia EN: Staining

Bibliografía

  1. Nezelof, Christian. Técnicas microscópicas. Ed. Jims. 1975. ISBN 8470921215
  2. Raimundo García del Moral. Laboratorio de anatomía patológica. Ed. Interamericana, McGraw-Hill. 1993. ISBN 8448102290
  3. Torres Seco, Fernando. Manual de técnicas en histología y anatomía patológica. Ed. Ariel. 2002. ISBN 843443704X
  4. McManus, J.F.A. Staining methods histologic and histochemical. Ed. Paul B. Hoeber. 1960.
  5. Horobin, Richard W. Troubleshooting histology stains. Ed. Churchill Livingstone. 2002. ISBN 044305312X
  6. Bancroft, John D. Manual of histological techniques and their diagnostic application. Ed. Churchill Livingstone. 2008. ISBN 9780443102790
  7. Wick, Mark R. Diagnostic histochemistry. Ed. Cambridge University Press. 2008. ISBN 9780521874106
  8. Kiernan, J.A. Histological and histochemical methods : Theory and practice. Ed Scion. 2010. ISBN 9781904842422
  9. Juan Rosai. Rosai and Ackerman's Surgical Pathology. Chapter 3. Special techniques in surgical pathology. pp 37- 91. Ed. Mosbi. 2004. ISBN 0323013422
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